农药残毒速测专用试剂包及现场检测技术研究

农药是农业生产的重要保障之一, 但滥用或过量施用会造成作物中农药残留量过高, 以致对人类的身体健康造成严重的威胁。不仅在蔬菜水果上农药残留量超标较为严重, 在粮食、肉类以及茶叶上面也经常含有大量残留农药^{[ 1~ 3]} , 从而导致中毒事件的发生。农药中有机磷和氨基甲酸酯类目前应用范围**广, 由此引起的农药中毒事件也十分严重。因此, 加强对农作物中有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测是非常重要的事情。目前对农药残留的检测, 常见的有各种色谱法^{[ 4~ 7]} , 以及越来越广泛研究的酶抑制法^{[ 8, 9]} 。酶抑制法具有快速、灵敏、费用低、特异性强和适于现场大批量样品筛选等优点^{[ 10]} , 但大多数还存在着试剂保存和移取的困难^{[ 9]} , 因而很难实现现场检测。农药残毒检测仪专用试剂包是针对文献^{[ 11, 12]} 中的手持式农药残毒速测仪和六通道农药残毒快速检测仪而研制的, 具有保存时间长、条件简单、试剂移取方便准确等显著优点, 可以实现现场快速检测。

1 实验部分

111 主要仪器与试剂手持式农药残毒速测仪: 自行设计组装的一种光度分析仪器, 由硅光单色光源 ( 波长为 407nm) 、透镜、圆柱型比色池( 光程为 210cm) 、光电管、集成光电传感器和信号微处理器构成^{[ 11]} ; 六通道农药残毒速测仪, 在手持式农药速测仪基础上自行组装的一套六通道同时快速检测农药残毒的装置^{[ 12]} ; UV- 2501 分光光度计( 日本 Shimadzu公司) ; 超声提取器, 由昆山市超声仪器有限公司生产的KQ118 型超声清洗器改装而成。

pH 8102 缓冲溶液: 011mol/ L 的磷酸盐水溶液; pH 810Tris 盐缓冲溶液; 底物溶液, 适量碘化硫代乙酰胆碱( ATchI) 用水溶解; 显色剂溶液, 缓冲溶液溶解适量的 5, 5c- 二硫代- 2, 2c- 二硝基苯甲酸( DTNB) ; 酶溶液, 缓冲溶液溶解适量乙酰胆碱酯酶(AchE) ; 胆汁酸钠( Sigma 公司) ; 牛磺酸钠。

112 试剂包设计及检测原理试剂包用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒, 其检测机理基于生物体内一种基本的生化反应^{[ 11]} , 即乙酰胆碱在水解酶乙酰胆碱酯酶 (AchE) 催化下迅速水解为乙酸和胆碱, 胆碱与显色剂反应生成显色物, 整个反应为酶催化动力学反应。本实验针对的底物为碘化硫代乙酰胆碱[ I( CH3) 3 NCH2CH2SCOCH3 ] , 以 DTNB 为显色剂,其反应产物为黄色物质, 于特征波长 K= 407nm 处的吸光度在一定时间范围内随时间的延伸吸光度提高, 其变化曲线为直线。当有机磷及氨基甲酸酯杀虫剂抑制生物体内的乙酰胆碱酯酶 (AchE) 使其失活时, 催化反应将变慢, 造成胆碱能神经系统的化学传递物质) ) ) 乙酰胆碱的积累, 从而引起神经中毒, 此时曲线的斜率将变小。用酶抑制率表示酶被农药抑制程度, 即农药残留毒性的大小, 可以下式表示:酶抑制率 =  ( A -  B) /  .  A @ 100%

式中: A 是一定量AchE 催化显色反应的吸光度随时间变化的直线斜率; B 是 AchE 受农药中毒后, 催化显色反应的吸光度随时间变化的直线斜率。

通常的酶抑制法所遇到的**大问题是酶易失活而难用于现场操作。为此, 本试剂包通过加入适量特定的表面活性剂, 既可以起到杀菌消毒的作用, 又可以对试剂包中的主要成分乙酰胆碱酯酶起到固定化的作用^{[ 13~ 15]} 。再加上采用真空包装, 可以有效的抑制微生物的生长繁殖, 这样酶试剂可以保存比较长的时间。

113 实验方法每个试剂包装有检测 125 个待测样品的量。

测空白时, 将磷酸盐缓冲溶液加到比色瓶 4mL 刻度处, 然后将比色瓶放入手持式农药残毒速测仪中调零, 加入两滴酶和两滴显色剂, 室温放置 15min, 再加入两滴底物, 振荡均匀, 放入仪器中按下测定键, 仪器会自动测出此时的以及 3min 后的吸光度, 并计算出差值。测样品时, 使用口袋电子台秤称取 110g 蔬菜样品, 剪成 1cm 见方大小, 放入样品瓶中, 再使用装有缓冲液的洗瓶向其中加入4mL 缓冲溶液, 室温放置 15min, 然后加入酶和显色剂各两滴, 以后各步骤同空白测量。仪器可以根据前面测得的 4 个吸光度值直接计算出酶抑制率, 并显示在液晶屏幕上。整个操作过程不需要玻璃量器以及其他大型仪器, 操作简单快速, 可以实现现场检测。

11311 试剂包配比酶试剂: 取 6215LL 原酶液, 加入 10mg 牛磺酸钠, 用 Tris 盐缓冲溶液将其稀释到 5mL, 取出 013mL 放在一个小玻璃瓶中为一个包装, 抽成真空后封口, 平时于 4 e 冰箱中保存, 使用时, 用缓冲液稀释到 10mL, 可以检测 125 组样品; 底物试剂: 取 014g 碘化硫代乙酰胆碱, 用水稀释到100mL, 每个试剂包内装 10mL, 可以检测 125 组样品。

显色剂溶液: 015g DTNB, 用磷酸盐缓冲溶液稀释到100mL, 每个试剂包内装 10mL, 可以检测 125 组样品。

11312 试剂包包装设计每个酶试剂包用小玻璃瓶封装, 并抽真空, 于 4 e 冰箱中保存, 使用时, 将小瓶内 013mL 的试剂取出, 转移到塑料滴瓶中, 加入缓冲液到 10mL 刻 
度处, 检测样品时, 滴入两滴进行定量检测。缓冲溶液也用塑料滴瓶盛装, 方便取用。这样, 在进行现场检测操作时, 不需要很多玻璃器皿, 使得操作方便快捷, 可靠性高。

2 结果与讨论

211 酶的活性的考察方式乙酰胆碱酯酶可以催化底物发生相应的反应, 其产物的量可以用显色剂 DTNB 的变色情况来衡量。当一定量的底物在酶的作用下反应的量越多, 则说明酶的催化能力越强, 酶活性越高。因此酶的活性可以用 DTNB 的吸光度在相同时间内的变化情况来衡量, 在实验特定的底物和酶的浓度条件下, DTNB 在一定时间内的吸光度变化情况如图1 所示。
加其活性会大幅降低。实验考察了加入不同添加剂时, 液态酶的活性变化, 其结果如表 1所示。从表中可见, 添加 10mg 牛磺酸钠, 可以有效的提高酶的活性, 使AchE 酶在 4 e 的真空保存时间延长, 同时可以延长在室温下的保存时间, **少可以达到1 个月, 从而为现场检测创造了条件。 213 缓冲体系的选择考察了分别用 tris 盐和磷酸盐缓冲溶液配置的乙酰胆碱酯酶溶液的活性, 结果表明, 前者比后者活性约高 4% , 故酶试剂包使用 Tris 缓冲液配置。

214 滴瓶加入试剂的**性经测定, 每滴试剂均为 40LL, 每次加入各种试剂均为两滴。采用此滴瓶加入试剂与使用移液器对同一样品测定结果相比较, 相对误差不超过2% 。

215 样品提取条件的选择使用磷酸盐缓冲溶液在室温浸泡 15min 来提取样品上的农药残留, 可以减少检测所需的其他仪器和条件, 两者的比较见表 2。 药残毒。由表可见, 3 种样品使用试剂包及手持式农药残毒速测仪测量的结果与 GC-MS 法的完全吻合, 只有样品 4 的检测结果稍有出入, 但现场检测数据也表明农药仅略微存在。